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Im Rahmen dieser Dissertation wurde zum besseren Verständnis der molekularen Vorgänge in der Chondrogenese die Rolle des Proteins MIA/CD-RAP mit Hilfe der MIA-knockout-Maus untersucht. Eine anfängliche Studie zum Auftreten von spontaner Osteoarthrose (OA) gab Hinweise auf eine verminderte Ausbildung von OA in MIA-knockout-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Diese Beobachtung wurde in Mausmodellen zur Untersuchung von Knorpelschädigung und -entwicklung weiter verfolgt, um zu klären, ob MIA/CD-RAP für Knorpelstabilität und -entwicklung wichtig ist. In einem Modell zur Induktion von Osteoarthrose und in einem Frakturheilungsmodell konnte interessanterweise eine erhöhte Knorpelregeneration in MIA-knockout-Mäusen gezeigt werden. Durch den Verlust von MIA/CD-RAP kommt es zu einer erhöhten Proliferation von Chondrozyten, was zur erhöhten Regenerationsfähigkeit des Knorpels beiträgt. In vitro konnte ebenfalls eine erhöhte Proliferation von mesenchymalen Stammzellen, isoliert aus MIA-knockout-Mäusen, bestätigt werden. Diese weisen zusätzlich eine verzögerte Differenzierung auf. Die Analyse von Gewebe aus MIA-knockout-Mäusen zeigte eine stark verminderte Expression des Proteins NONO (p54nrb), einem kürzlich beschriebenen Aktivator der Sox9-abhängigen Förderung der Chondrogenese. In dieser Dissertation konnte p54nrb als Zielprotein von MIA/CD-RAP identifiziert werden, über welches die MIA/CD-RAP-abhängige Förderung der Chondrogenese vermittelt wird. MIA/CD-RAP fördert dabei die Chondrogenese über eine Proliferationsinhibition von chondrogenen Vorläuferzellen, was durch eine Inhibition der Cyclin D2-Expression erreicht wird. Desweiteren wird die Differenzierung von chondrogenen Vorläuferzellen durch eine p54nrb-gesteuerte Aktivierung der Kollagen Typ II-Expression gefördert. Weitere Ergebnisse dieser Dissertation zeigten, dass MIA/CD-RAP die p54nrb-Expression auf transkriptioneller Ebene reguliert. Es konnte eine hoch konservierte Region im p54nrb-Promotor identifiziert werden, welche nötig und ausreichend für die MIA/CD-RAP-abhängige Aktivierung ist. Die funktionelle Analyse dieses Promotorstücks identifizierte den Transkriptionsfaktor YBX1 als den Faktor, der die MIA/CD-RAP vermittelte Aktivierung der p54nrb-Transkription steuert. Immunhistochemische Untersuchungen, des bislang in der Chondrogenese noch nicht beschriebenen Transkriptionsfaktors YBX1, zeigten eine deutliche Expression in Chondrozyten der Wachstumsfuge. YBX1 konnte somit erstmalig als Mediator der MIA/CD-RAP Wirkung in der Chondrogenese beschrieben werden. Obwohl MIA/CD-RAP während der gesamten Chondrogenese exprimiert wird, entwickeln sich MIA-knockout-Mäuse normal und zeigen neben ultrastrukturellen Veränderungen der Knorpelmatrix keine Fehlbildungen des Skeletts oder anderer Organe. Um den Grund für diesen annähernd normalen Phänotyp des adulten Skelettsystems von MIA-knockout-Mäusen zu erforschen, wurden die molekularen Abläufe im Prozess der enchondrale Ossifikation von MIA-defizienten-Embryonen in vivo untersucht. Es wurden redundante Mechanismen erwartet, welche den MIA/CD-RAP-Verlust kompensieren. In situ Hybridisierungen zeigten eine vergrößerte Zone an proliferierenden Kollagen Typ II- und Sox9-exprimierenden Chondrozyten in der Wachstumsfuge von 15,5 Tage alten MIA-defizienten-Embryonen. Gleichzeitig war der Bereich an Kollagen Typ X-exprimierenden hypertrophen Chondrozyten im Vergleich zum Wildtyp deutlich reduziert, was auf eine Verzögerung der hypertrophen Differenzierung schließen ließ. In vitro Experimente an mesenchymalen Stammzellen konnten eine erhöhte Expression der Transkriptionsfaktoren Sox9 und Sox6 bestätigen, was auf eine redundante Regulation aufgrund einer verminderten p54nrb-Expression zurückzuführen war. Sox9 und Sox6 halten Chondrozyten in Proliferation und inhibieren deren hypertrophe Differenzierung. Erstaunlicherweise wurde an Tag 16,5 der Embryonalentwicklung die zunächst verzögerte Differenzierung von Chondrozyten der Wachstumsfuge durch einen vergrößerten Bereich an hypertrophen Chondrozyten kompensiert. Dies war vermutlich auf eine Verminderung der transkriptionellen Aktivität von CREB und AP1 zurückzuführen. Die Veränderung der CREB- und AP1-Aktivität könnte somit als sekundärer redundanter Mechanismus in MIA-knockout-Mäusen dienen, welcher der zunächst gehemmten enchondrale Ossifikation entgegenwirkt und letztendlich ein normal entwickeltes Skelett ermöglicht. Auf welche funktionelle Weise diese Gegenregulation stattfindet und wie MIA/CD-RAP die CREB- bzw. AP1-Aktivität moduliert, muss allerdings in weiteren Experimenten noch geklärt werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass MIA/CD-RAP für die Chondrozytendifferenzierung benötigt wird. Die Effekte auf die Differenzierung werden dabei über p54nrb vermittelt.
In this dissertation, the role of the protein MIA/CD-RAP was investigated with the help of the MIA-knockout-mouse to better understand the molecular events during chondrogenesis. An initial study on spontaneous emerging osteoarthritis (OA) revealed reduced OA in MIA-knockout-mice compared with wild type mice. This finding was further addressed in mouse models for cartilage destruction and cartilage formation to reveal whether MIA/CD-RAP is important for cartilage stability and cartilage development. Interestingly, enhanced cartilage regeneration in MIA-knockout-mice could be shown in models for induction of osteoarthritis and fracture healing. MIA/CD-RAP loss leads to enhanced chondrocyte proliferation what contributes to increased cartilage regeneration potential. In vitro studies using mesenchymal stem cells isolated from MIA-knockout-mice confirmed the enhanced proliferation ability due to MIA/CD-RAP loss and showed delayed differentiation. Analysis of cartilage tissue derived from MIA-knockout-mice revealed reduced expression of the protein NONO (p54nrb), a recently described activator of Sox9-dependent activation of chondrogenesis. In this dissertation, p54nrb could be identified as a target gene of MIA/CD-RAP to promote chondrogenesis. MIA/CD-RAP stimulates chondrogenesis through inhibition of proliferation of cartilage precursor cells, mediated by reduced Cyclin D2 expression. Moreover, differentiation of cartilage precursor cells is supported by p54nrb mediated activation of collagen type II expression. Further results showed that MIA/CD-RAP regulates p54nrb expression on transcriptional level. One highly conserved region in the p54nrb promoter could be identified that is necessary and sufficient for MIA/CD-RAP-dependent activation. Functional promoter analysis identified the transcription factor YBX1 as the mediator of MIA/CD-RAP activation of p54nrb transcription. YBX1 has not been investigated in chondrogenesis thus far. Immunohistochemical examinations of YBX1 expression revealed distinct expression in chondrocytes of the growth plate. Consequently, YBX1 could be identified as a mediator of MIA/CD-RAP action in chondrogenesis for the first time. Although MIA/CD-RAP is expressed throughout chondrogenesis, MIA-knockout-mice develop normally und show no major abnormalities of the skeleton or other organs besides changes in the ultrastructure of the cartilage extracellular matrix. To explain the almost normal phenotype of the skeleton of adult MIA-knockout-mice the molecular process of endochondral ossification of MIA-deficient embryos was investigated in vivo, since we assume redundant mechanism which compensate MIA/CD-RAP loss. In situ hybridisation analysis revealed larger expression areas of Col2a1 and Sox9 positive, proliferating chondrocytes in the growth plate of 15.5 day old MIA-deficient embryos. At the same time, the expression area of Col10a1 positive chondrocytes was clearly reduced compared to wild type embryos, suggesting delayed hypertrophic differentiation. In vitro studies using mesenchymal stem cells confirmed the enhanced expression of the transcription factors Sox9 and Sox6, what arose from a redundant regulation because of diminished p54nrb expression. Sox9 and Sox6 maintain proliferating chondrocytes in proliferation and inhibit hypertrophic differentiation. Surprisingly, the initial delayed hypertrophic differentiation of chondrocytes of the growth plate was compensated at day 16.5 of embryonic development in MIA-knockout-mice by an enhanced area of hypertrophic chondrocytes. This was probably due to reduced transcriptional activity of CREB and AP1. Altered CREB- and AP1-activity could serve as a second redundancy mechanism in MIA-knockout-mice, which rescues the initial delayed endochondral ossification and finally allows normal skeletal development of MIA-knockout-mice. However, on which way this regulation occurs and how MIA/CD-RAP modulates CREB- and AP1-activity has to be clarified in further experiments. In summary, in this dissertation it could be shown that MIA/CD-RAP is needed for chondrocyte differentiation. The effects on differentiation are thereby mediated via the protein p54nrb. |
