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Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) has several therapeutic indications including cancer, dermatological diseases and neurological disorders. For the clinical studies, high 106–108 plaque forming unit per mL (PFU mL-1) formulated virus doses are required. Supplying this amount of virus is challenging since the upstream process titer is influenced by numerous, non-linearly dependent parameters as well as by the genetic nature of the virus. The aim of this work was to characterize and mathematically model the wild-type HSV-1 production process as a basis for producing high quantity and quality virus. Three HSV-1 permissive cell lines (Vero, suspension HEK-293 and BHK-21) were considered for the production. However, due to the superior Vero cell productivity, the process development focused on Vero cells growing on Cytodex 1 microcarrier in a stirred tank bioreactor. Results showed that temperature (33 and 37 °C), pH (6.5–7.4) and medium exchange before time of infection (TOI) are not only factors for improving the virus titer but also the virus quality (ratio of PFU to virus genome copies). For the first time, the HSV-1 production—from cell inoculation until harvest—was described with a mathematical model. This model was used to maximize the virus titer by varying the TOI (2–3.5 days) and multiplicity of infection (MOI) (0.0001–0.1), which was possible without compromising the virus quality. This work revealed that ammonium accumulation in Vero cell cultures inhibits HSV-1 propagation, even more severely in higher cell density cultures. Using pyruvate or GlutaMAX supplementation instead of L-glutamine reduced the ammonium accumulation and increased the virus titer 2.9-fold in high cell density cultures (3.5 x 106 cells mL-1) in shaking flask, respectively. Alternatively, applying a daily medium exchange after TOI in glutamine cultures also led to comparable titers to pyruvate and GlutaMAX cultures. Overall, increasing the cell density from 1.0 x 106 cells mL-1 to 3.7 x 106 cells mL-1 for the TOI increased the titer 1.9-fold and space-time yield 1.6-fold in pyruvate bioreactor cultures. Genetically modified HSV-1 vectors were produced by applying the wild-type HSV-1-based process. While the insertion sites and transgenes (for targeting tumor cells or immune checkpoint inhibitor) into the virus genome decreased the virus titer 2.7–4.5 fold, the production of these viruses was still economically feasible. Yet attenuating the virus (by deletion of UL39 and mutation of UL37 gene) resulted an order of magnitude lower titer than the wild type virus and will require a complementing Vero cell line to achieve economic production titers.
Das Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) hat mehrere therapeutische Indikationen, darunter Krebs, Hautkrankheiten und neurologische Störungen. Für klinische Studien werden hoch formulierte Virusdosen im Bereich von 106 bis 108 Plaque formenden Einheiten per mL (PFU mL-1) benötigt. Die Bereitstellung dieser Virusmenge stellt eine Herausforderung dar, da der Titer des Upstream-Prozesses von zahlreichen, nicht linear abhängigen Parametern, sowie von der genetischen Beschaffenheit des Virus beeinflusst wird. Ziel dieser Arbeit war es, den Wildtyp-HSV-1-Produktionsprozess zu charakterisieren und mathematisch zu modellieren, um eine Grundlage für die Produktion von Viren in hoher Quantität und Qualität zu schaffen. Drei HSV-1-permissive Zelllinien (Vero, HEK-293 und BHK-21) wurden für die Produktion in Betracht gezogen. Aufgrund der überlegenen Produktivität der Vero-Zellen konzentrierte sich die Prozessentwicklung auf Vero-Zellen, die auf Cytodex 1 in einem Rührkessel Bioreaktor gewachsen sind. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Wahl der Temperatur (33 und 37 °C) und des pH-Werts (6,5-7,4) als auch der Austausch des Mediums vor dem Infektionszeitpunkt (TOI) den Virustiter und die Virusqualität (Verhältnis von PFU zu Virusgenomkopien) beeinflussen. Zum ersten Mal wurde die HSV-1-Produktion—von der Zellinokulation bis zur Ernte—eines mathematischen Modells beschrieben. Dieses Modell wurde verwendet, um den Virustiter durch Variation der TOI (2-3,5 Tage) und der Multiplizität der Infektion (MOI) (0,0001-0,1) zu maximieren, was ohne Beeinträchtigung der Virusqualität möglich war. Diese Arbeit enthüllte, dass die Anreicherung von Ammonium in Vero-Zellkulturen die Vermehrung von HSV-1 hemmt und dieser Effekt mit erhöhter Zelldichte zunehmend ist. Durch Verwendung von Pyruvat oder GlutaMAX anstelle von L-Glutamin konnte diese Ammoniumakkumulation verringert werden, was zu einem 2,9-fach erhöhten Virustiter in Kulturen mit hoher Zelldichte (3,5 x 106 Zellen mL-1) im Schüttelkolben führte. Alternativ dazu führte ein täglicher Mediumwechsel nach TOI zu vergleichbaren Erträgen mit Glutamin wie unter Verwendung von Pyruvat und GlutaMAX. Insgesamt verbesserte die Erhöhung der Zelldichte von 1,0 x 106 auf 3,7 x 106 Zellen mL-1 den Titer um das 1,9-fache und die Raumzeitausbeute um das 1,6-fache in Pyruvat-Bioreaktorkulturen. Zusätzlich wurden gentechnisch veränderte HSV-1-Vektoren durch Anwendung des Wildtyp-HSV-1-basierten Verfahrens hergestellt. Obwohl die Insertionsstellen und Transgene (für Zielsteuerung auf Tumorzellen oder den Immun-Checkpoint-Inhibitor) den Virustiter um das 2,7- bis 4,5-fache verringerten, war die Herstellung dieser Viren dennoch wirtschaftlich umsetzbar. Eine Abschwächung des Virus (durch Deletion von UL39 und Mutation des UL37-Gens) reduzierte den Titer jedoch um eine Größenordnung gegenüber dem Wildtyp-Virus und erfordert eine komplementäre Vero-Zelllinie, um wirtschaftliche Produktionserträge zu erzielen. |
