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Cardiovascular diseases are the leading cause of death globally. Cardiomyocytes (CMs) have poor proliferative capacity, and the therapeutic options to restore heart function are limited. However, there are several promising strategies for cardiac regeneration. The most promising approach is cell transplantation therapy using newly generated CMs. Induced cardiomyocytes (iCMs) generated from cardiac fibroblasts (CFs) represent a potential cell population. However, the iCM reprogramming efficiency is low and mature iCMs do not proliferate. Here I report the generation of proliferative iCM precursor cells (iCMPs) with CM lineage commitment by genetic reprogramming. CFs were reprogrammed into iCMPs via transduction with cardiomyogenesis-related transcription factors Gata4, Mef2c, Tbx5 and Myocd. Global transcriptome profiling of iCMPs, CFs and mouse adult CMs was performed by RNA sequencing. For differentiation into iCMs, the effectiveness of previously established differentiation conditions was tested. I then extended the approach to the native heart environment. The therapeutic potential of iCMPs was evaluated in a in a rodent model of ischemic heart disease. iCMPs expressed α-actinin, cTnT and myosin protein as observed by immunocytology. The iCMPs were a heterogenous population of cTnT positive cells, most of which showed a round epithelial like cells morphology. These iCMPs could robustly proliferative and when supplemented with ascorbic acid could maintain a stable phenotype. Pure populations of iCMPs were obtained by transcriptional selection with Myh6/7-targeting molecular beacons. Maturation studies showed that iCMPs displayed elongated sarcomere-like structures after stimulation with 5- Azacytidine a general demethylating agent, which has previously been described for differentiation toward cardiomyocytes. Gene expression pattern suggests that these iCMPs displayed a unique gene expression profile that move towards CM development. In addition, when transplanted into rodent hearts following myocardial infarction (MI), they show improved cardiac function such as left ventricular ejection fraction.In conclusion I can transdifferentiate fibroblasts into cardiomyogenic cells that can be purified using a clinically compatible molecular beacon technique, can be expanded to yield therapeutic cell doses and exert therapeutic benefits. Thus, iCMPs are a potential candidate for cardiac cell therapy.
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache. Kardiomyozyten (CMs) haben eine geringe Proliferationskapazität und die therapeutischen Möglichkeiten zur Wiederherstellung der Herzfunktion sind begrenzt. Der wohl vielversprechendste Ansatz zur Herzregeneration ist die Transplantation von CMs. Eine mögliche Zielpopulation sind induzierte Kardiomyozyten (iCMs), die aus Herzfibroblasten (CFs) erzeugt werden. Allerdings ist die Effizienz der iCM-Reprogrammierung gering und reife iCMs sind nicht in der Lage, sich zu vermehren. Eine Lösung dieses Problems ist gleichfalls das Ziel der vorliegenden Arbeit: die Erzeugung proliferativer iCM-Vorläuferzellen (iCMPs) mit CM-Abstammung durch genetische Reprogrammierung. CFs wurden durch Transduktion verschiedener Transkriptionsfaktoren, die im Zusammenhang mit der Kardiomyogenese stehen, beispielsweise Gata4, Mef2c, Tbx5 und Myocd, in iCMPs umprogrammiert. Die Untersuchung des Transkriptoms erfolgte durch RNA-Sequenzierung. Weiterhin wurde die Effizienz bereits etablierter Kultivierungsbedingungen bezüglich der Differenzierung dieser Zellen in CMs untersucht. Dieser Ansatz wurde anschließend auf die native Herzumgebung ausgedehnt. Schließlich wurde das therapeutische Potenzial von iCMPs in einem Nagetiermodell für ischämische Herzerkrankungen bewertet. Immunzytologische Untersuchungen zeigten, dass die generierten iCMPs α-Actinin und Myosin exprimieren. Sie stellen eine heterogene Population von cTnT-positiven Zellen dar, von denen die meisten eine kreisförmige epitheliale Zellmorphologie aufwiesen. Sie waren in der Lage, sich zu vermehren und unter Zugabe von Ascorbinsäure wiesen sie einen stabilen Phänotyp auf. Nach Transkriptionsselektion mit Myh6/7-abzielender molecular beacons wurde eine reine Population an iCMPs gewonnen. Reifungsstudien zeigten, dass iCMPs nach Stimulation mit 5-Azacytidin verlängerte sarkomerartige Strukturen haben. Zudem legt das Genexpressionsmuster nahe, dass diese iCMPs ein einzigartiges Genexpressionsprofil besitzen. Wurden sie nach einem Myokardinfarkt (MI) in Nagetierherzen transplantiert, übten sie darüber hinaus therapeutische Vorteile, wie eine verbesserte Herzfunktion, aus.Zusammenfassend war es möglich, Fibroblasten in kardiomyogene Zellen zu transdifferenzieren und sie unter Verwendung einer klinisch kompatiblen molecular beacon-Technik zu isolieren. Anschließend wurden sie kultiviert, um therapeutische Zelldosen zu erzielen und therapeutische Vorteile, wie eine verbesserte Herzfunktion, zu ermöglichen. Insgesamt stellen iCMPs einen aussichtsreichen Kandidaten für eine Herzzelltherapie dar. |
