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All members of the guild of sulfate reducing prokaryotes (SRP) gain energy via dissimilatory sulfate reduction. The phylogenetic inhomogeneity of this group does not allow to target 16S ribosomal RNA genes of all its members with a simple set of oligonucleotide probes or PCR primers. It is further impossible to identify novel lineages of SRP by their ribosomal RNA solely. Thus, the suitability of the dissimilatory (bi-) sulfite reductase (DSR), a key enzyme of the dissimilatory sulfate reduction pathway, as alternative phylogenetic marker molecule for SRP was investigated. For this purpose, the evolutionary history of the DSR was studied using a large collection of pure culture SRP and correspondence with the 16S rRNA gene based phylogeny was inspected. In addition, cultivation independent SRP diversity surveys were carried out based on comparative amino acid sequence analysis of environmentally retrieved dsr clones in order to test whether cultured representatives of SRP adequately represent the natural diversity of this guild. In order to build up an encompassing DSR reference data base, existing primers were optimized to PCR amplify a 1.9 kb dsrAB fragment from 30 pure culture reference strains. These stains represented all lineages of SRP recognized at this time. dsrAB gene fragments were cloned and sequenced. Subsequent comparative phylogenetic sequence analyses of all available DsrAB pure culture sequences and their corresponding 16S rRNA gene sequences lead to the discovery of at least three presumptive lateral dsr gene transfer events from (i) a deltaproteobacterial donor to the genus Thermodesulfobacterium, (ii) a deltaproteobacterial donor related to Desulfobacterium anilini to certain Desulfotomaculum strains, and (iii) a bacterial donor to Archaeoglobus. Although these events complicate the interpretation of dsrAB-based SRP diversity studies, the Dsr-approach represents the best available method for simultaneous detection of recognized and novel SRP in environmental samples. In this thesis, the Dsr-approach was applied to investigate SRP diversity in the water column of Mariager Fjord (Denmark), and Solar Lake (Egypt), as well as tissue material from a marine worm. The sequences originating form these studies were analyzed along with 550 publicly available environmental dsrAB sequences. 13 environmental SRP lineages without closely related isolated or sequenced SRP reference strains were identified suggesting that many environmentally important SRP lineages have not yet been successfully cultured. Further, a detailed inspection of all available environmental dsrAB sequences revealed characteristic SRP lineages in different ecosystems like soil, sediment, marine water, hypersaline water, and in symbiotic relationships. In conclusion, this thesis showed that lateral gene transfer was significantly influencing the evolutionary history of the DSR. The generally accepted opinion of strict vertical transmission of the key enzyme of dissimilatory sulfate reduction has to be adjusted. Nevertheless, it could be demonstrated that the Dsr approach is a valid tool for investigating the diversity and biogeography of SRPs. Alle Mitglieder der Gilde der sulfatreduzierenden Prokaryonten (SRP) gewinnen ihre Energie mittels dissimilatorischer Sulfatreduktion. Wegen der phylogenetischen Uneinheitlichkeit dieser Gruppe können die ribosomalen 16S- rRNA- Gene ihrer Mitglieder nicht mit einem einfachen Satz von Oligonukleotidsonden oder PCR- Primern erfasst werden. Ferner ist es nicht möglich neue Linien von SRP alleine anhand ihrer ribosomalen RNA- Gene zu erkennen. Aus diesen Gründen wurde die Eignung der dissimilatorischen (Bi-) Sulfitreduktase (DSR), einem Schlüsselenzym der dissimilatorischen Sulfatreduktion, als alternatives phylogenetisches Markermolekül für SRP untersucht. Hierzu wurde die evolutionäre Geschichte der DSR anhand einer großen Auswahl von SRP Reinkulturen näher betrachtet und die Übereinstimmung mit der 16S- rRNA- Gen basierenden Phylogenie überprüft. Zusätzlich dazu wurden kultivierungsunabhängige SRP- Diversitätsstudien auf der Grundlage vergleichender Aminosäuresequenzanalysen von umweltstämmigen dsr- Klonen vorgenommen, um festzustellen, ob die kultivierten Repräsentanten der SRP das natürliche Vorkommen dieser Gilde widerspiegeln. Um eine umfassende Referenzdatenbank aufzubauen wurden existierende Primer so optimiert, dass ein 1.9 kb großes dsrAB Genfragment von 30 Reinkulturreferenzstämmen mittels PCR amplifiziert werden konnte. Diese untersuchten Stämme repräsentierten alle, zum Beginn der Doktorarbeit bekannten, SRP- Linien. Die dsrAB- Genfragmente wurden kloniert und sequenziert. Anschließende vergleichende phylogenetische Analysen aller verfügbaren DsrAB- Sequenzen und ihrer entsprechenden 16S- rRNA- Gensequenzen führte zur Entdeckung von mindestens drei (mutmaßlichen) lateralen dsr- Genstransferereignissen von (i) einem deltaproteobakteriellen Donor zu Thermodesulfobacterium, (ii) einem mit Desulfobacterium anilini verwandten, deltaproteobakteriellen Donor zu bestimmten Desulfotomaculum Stämmen und (iii) einem bakteriellen Donor zu Archaeoglobus. Obwohl diese Ereignisse die Interpretation von dsrAB- basierenden SRP- Diversitätsstudien komplizieren, bleibt der dsr Ansatz die am besten geeignete Methode zum gleichzeitigen Nachweis von bekannten und neuen SRP in Umweltproben. In der vorliegenden Arbeit wurde der Dsr-Ansatz verwendet um die Artenvielfalt der SRP in der Wassersäule des Mariager Fjords (Dänemark), des Solar Lakes (Ägypten) sowie in Gewebematerial eines marinen Wurms zu erforschen. Dsr- Sequenzen dieser Studien wurden zusammen mit 550 publizierten Dsr- Umweltsequenzen analysiert. Auf diese Weise wurden 13 Umwelt- SRP- Linien identifiziert, welche keinem nahe verwandten Isolat oder sequenzierten Reinkulturstamm zugeordnet werden konnten. Dies legt den Schluss nahe, dass viele wichtige Umwelt- SRP- Linien bis jetzt noch nicht erfolgreich kultiviert wurden. Detaillierte Untersuchungen aller zur Verfügung stehenden dsrAB- Sequenzen zeigten auf, dass charakteristische SRP- Linien in verschiedenen Ökosystemen wie Boden, Sediment, Meerwasser und in hypersalinem Wasser vorhanden sind. Zusammenfassend wurde mit dieser Doktorarbeit gezeigt, dass lateraler Gentransfer einen großen Einfluss auf die evolutionäre Geschichte der DSR hatte. Die Lehrmeinung der strikten vertikalen Weitergabe der Gene des Schlüsselenzyms der dissimilatorischen Sulfatreduktion muss somit überdacht werden. Dennoch erwies sich der Dsr-Ansatz als eine wertvolle Methode zur Untersuchung von Diversität und Biogeographie der SRP. |
