| الوصف: |
GPKRlerin kendileri ve diğer GPKRler ile eşleştikleri bilinmektedir, bu eşleşmenin reseptör intörnalizasyonu, olgunlaşması, işlev ve farmakolojisi üzerinde önemli rolü olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmanın ilk kısmında gelişmiş yeşil protein (EGFP) ve çift moleküllü floresan birleştirme metodu (BiFC) tekniğini kullanarak Ste2p proteinin kendisi ile etkileşimini ve bu etkileşimin hücre içindeki yerini tayin ettik. Yedinci transmembran altyapısından biri N-EGFP diğeri C-EGFP ile işaretlenmiş tam uzunluktaki Ste2p eşzamanlı olarak hücrelere ürettirildiğinde, eşleşmenin hem hücre zarında hem de hücre içerisinde olduğu BiFC metodu ile gösterildi. Yedinci transmembran altyapısından N-EGFP ve C-EGFP ile işaretlenmiş C kuyruğu kesik Ste2p reseptörlerinde ise eşleşme sadece hücre zarında gözlemlendi. EGFP parçalarıyla işaretli tam uzunluktaki ve kuyruğu kesik reseptörler hücrede eşzamanlı ürettirildiğinde ise eşleşmenin hem hücre zarında hem de hücre içerisinde olduğu, dolayısıyla kesik reseptörlerin, tam uzunluktaki reseptörlerle etkileşebildiği gözlemlendi. BiFC metodundaki floresan sadece ikili eşleşmeyi gösterebilmektedir, reseptörlerin ikiden fazla etkileşimlerinin olup olmadığı bu metotla gösterilememektedir. İki moleküllü floresan birleşme (BiFC) metodunu kullanarak, Ste2p reseptörlerinin hücre zarına monomer olarak taşındığını, zarda eşleştiklerini gösterdik. C-kuyruğu kesik reseptör çiftlerinin hücre zarından intörnalize olmadıklarını, tam uzunluktaki reseptör çiftlerininse ikili ya da çoklu eşleşerek intörnalize olduklarını gösterdik. Bu çalışma, maya feromon reseptörü olan Ste2p'nin hücre zarında eşleştiğini ve ikili ya da çoklu olarak intörnalize olduklarını göstermektedir. Kullanılan BiFC metodu kesik ve tam uzunluktaki reseptörlerin nerede eşleştikleri hakkında ilk delilleri sunmaktadır. Çalışmanın ikinci kısmında ise, Yedinci transmembran altyapısından biri N-mCherry diğeri C-mCherry ile işaretlenmiş tam C-kuyruğu kesik Ste2p reseptörleri ve tam uzunluktaki EGFP ve mCherry ile işaretlenmiş, C-kuyruğu kesik ve tam uzunluktaki reseptörler kullanılarak, endositoz, kolokalizasyon ve FRET metodlarıyla üçlü ve dörtlü reseptör etkileşimleri tespit edilmiştir. GPCRs are known to form homo- and hetero-dimers and this interaction could have important roles in internalization, maturation, function and/or pharmacology of these receptors. In the first part of the study bimolecular fluorescence complementation (BiFC) using split enhanced green fluorescent protein (EGFP) was used to determine the interaction and cellular location between various Ste2p constructs. Co-expression of two constructs, one with the N-terminus of EGFP inserted into the full-length receptor at the end of the 7th transmembrane domain and the other with the C-terminus of EGFP inserted at the same position, led to the discovery of dimers both at the cell surface and intracellularly as shown by BiFC. Only cell surface dimerization was observed when truncated receptors with the N-terminus of EGFP or the C-terminus of EGFP attached to the 7th transmembrane domain were co-expressed. Co-expression of EGFP-tagged truncated receptors with tagged full-length receptors showed dimers intracellularly and on the plasma membrane indicating that truncated receptor could interact with full-length receptor. Fluorescence as a result of BiFC requires dimer formation, but whether the receptors were also forming higher order aggregates could not be determined by the method used. Using bimolecular fluorescence complementation, we present the evidence that both full length and C-terminally truncated Ste2p traffics to the membrane as a monomer and forms dimers on the cell membrane. C-terminally truncated receptors do not appear to be internalized. In contrast, full-length receptors can internalize as dimers and/or higher oligomers. This study shows that yeast pheromone receptor, Ste2p dimerize on the plasma membrane and are internalized as dimers or oligomers. The BiFC method provided the first evidence of the localization of dimers of truncated and full-length Ste2p. In the second part of the study, BiFC constructs from the first part and new BiFC constructs; truncated receptors with the N-terminus of mCherry or the C-terminus of mCherry attached to the 7th transmembrane domain; as well as, full length or truncated receptors tagged with full length EGFP or mCherry was used to show three and four receptor oligomerization of Ste2p, taking advantage of endocytosis using colocalization and FRET methods. 219 |
