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Das E2F-assozierte Phosphoprotein EAPP interagiert mit den aktivierenden Mitgliedern der E2F Transkriptionsfaktor Familie, wodurch es die Transkription von Genen steigert, die das Fortschreiten des Zellzyklus fördern, und zugleich störend auf E2F1-induzierte Apoptose einwirkt. Deshalb wird vermutet, dass EAPP eine Rolle in der Tumorgenese spielt, was durch seine häufige Hochregulierung in transformierten Zelllinien bekräftigt wird. EAPP kann ebenso unabhängig von E2F agieren da es beispielsweise als Reaktion auf Stress oder DNS Schädigung die Expression von p21 stimuliert indem es an dessen Promoter bindet. Um die zelluläre oder molekulare Rolle eines Proteins zu untersuchen ist es oft hilfreich, die Aktivität dieses Proteins zu regulieren, was zum Beispiel durch Fusion mit den Ligandenbindungs Domänen von nuklearen Hormonrezeptoren erzielt werden kann. Ein aktuelles Beispiel dafür ist die N-terminale Fusion von EYFP und der Ligandenbindungs Domänen des Estrogenrezeptors mit E2F1 von Shats et al. (2017). Das Ziel dieses Projekts war es, das Plasmid von Shats et al. zu verwenden, um Liganden-abhängige EYFP-ER-EAPP Fusionsproteine zu kreieren, welche eingesetzt werden können, um die zelluläre Rolle von EAPP weiter zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde E2F1 mit verschiedenen EAPP Varianten ersetzt, nämlich Wildtyp (wt) EAPP, phospho-mutiertem (pm) EAPP und vier EAPP Trunkierungen. Die kreierten Konstrukte wurden mittels Sequenzierung und Restriktionsverdau verifiziert und stabil oder transient in U2OS und T98G Zellen transfektiert. Als die Reaktion der Konstrukte auf Tamoxifen und die daraus resultierenden Auswirkungen auf den Verlauf des Zellzyklus und die Reaktion auf DNS Schädigungen mittels Fluoreszenzmikroskopie, Western blotting und Durchflusszytometrie untersucht wurden, stellte sich heraus, dass die nukleare Translokation von EAPP nur in einem geringen Maß Liganden-reguliert war, während keine Hinweise für eine Liganden-abhängige Regulierung seiner transkriptionellen Aktivität gefunden wurden. Zudem gaben Western blot und RNA-seq Ergebnisse Grund zu der Annahme, dass die transkriptionelle Aktivität von EAPP beeinträchtigt wurde da keine Veränderungen in der Expression von bekannten EAPP und/oder E2F Zielgenen in U2OS wt + EYFP-ER-EAPP wt/pm Klonen im Vergleich zu U2OS wt Zellen vorhanden waren. Eine weitere Beobachtung, die gemacht wurde, war, dass EYFP-ER-EAPP wt fähig war, Tamoxifen-abhängige subnukleare Foci zu formen, was sich jedoch als Artefakt herausstellte, vermutlich verursacht durch die Überexpression und der daraus resultierenden Aggregation des Fusionsproteins mit Promyelocytic Leukemia (PML) nuklear Körpern. Dies führte zu der Entdeckung, dass EAPP vermeintliche Sumoylierungsstellen und ein SUMO interaction motif (SIM) besitzt. Schlussendlich wurde durch RNA-seq gezeigt, dass EYFP-ER-EAPP pm eine weitaus größere Auswirkung auf das allgemeine Expressionsprofil von U2OS wt Zellen hatte als EYFP-ER-EAPP wt. Es ist jedoch unklar, ob dieser Effekt nur klonal bedingt war. Die RNA-seq Ergebnisse wiesen zudem auf einige potenzielle neue EAPP Zielgene hin, wie etwa POU3F2, COL6A3 und ENOSF1, die noch validiert werden müssen. Außerdem deuteten die Ergebnisse auf eine Involvierung von EAPP in der Regulierung von Genen, die mit der Strukturierung von Kollagen und der extrazellulären Matrix zusammenhängen, hin. Abschließend ist zu sagen, dass, auch wenn die kreierten EYFP-ER-EAPP Konstrukte nicht voll funktionsfähig waren und daher nicht erlaubt haben, die Funktionen von EAPP weiter aufzuklären, die Ergebnisse, die während dieses Projekts gemacht wurden, einige interessante Fragen aufgebracht haben, die als Input für zukünftige Studien dienen können. Zwei Fragen von besonderer Bedeutung sind, ob EAPP sumoyliert wird und welche Rolle die Phosphorylierung von EAPP für die Regulierung seiner transkriptionellen Aktivität spielt. The E2F-associated phosphoprotein EAPP interacts with the activating members of the E2F transcription factor family, thereby increasing the transcription of genes promoting cell cycle progression while also interfering with E2F1-induced apoptosis. Thus, EAPP is believed to have a role in tumorigenesis which is corroborated by its frequent upregulation in transformed cell lines. EAPP can also act independently from E2F as it, for example, stimulates the expression of p21 in response to stress or DNA damage by binding to its promoter. In order to study the cellular or molecular role of a protein, it is often helpful to regulate the activity of that protein, which can, for example, be achieved by fusion to the ligand-binding domains of nuclear hormone receptors. A recent example for this is the N-terminal fusion of EYFP and the ligand-binding domain of the estrogen receptor to E2F1 by Shats et al. (2017). The aim of this project was to employ the plasmid from Shats et al. to create ligand-dependent EYFP-ER-EAPP fusion proteins which may be applied to further investigate the cellular role of EAPP. For this purpose, E2F1 was replaced with different EAPP variants, namely wild-type (wt) EAPP, phospho-mutated (pm) EAPP and four EAPP truncations. The created constructs were verified by sequencing and by restriction digest and were stably or transiently transfected into U2OS and T98G cells. By examining the response of the constructs to tamoxifen and the thereof resulting impact on cell cycle progression and the DNA damage response by fluorescence microscopy, Western blotting and flow cytometry it was revealed that the nuclear translocation of EAPP was only ligand-regulated to a minor degree, while no evidence was found for a ligand-dependent regulation of its transcriptional activity. Moreover, Western blot and RNA-seq results gave reason to believe that the normal transcriptional activity of EAPP was impeded as there were no changes in the expression of known EAPP and/or E2F target genes in U2OS wt + EYFP-ER-EAPP wt/pm clones compared to U2OS wt cells. Another observation made was that EYFP-ER-EAPP wt was capable of forming tamoxifen-dependent subnuclear foci which, however, turned out to be an artifact presumably caused by the overexpression of the fusion protein and its thereof resulting aggregation with promyelocytic leukemia (PML) nuclear bodies. This lead to the finding that EAPP possesses putative sumoylation sites and a SUMO interaction motif (SIM). Finally, RNA-seq showed that EYFP-ER-EAPP pm had a by far greater impact on the overall expression profile of U2OS cells than EYFP-ER-EAPP wt, but it is unclear whether this effect was only clonal. The RNA-seq results also indicated several potential new EAPP target genes, like POU3F2, COL6A3 and ENOSF1, which will have to be validated. Furthermore, the results hinted at an involvement of EAPP in the regulation of genes related to collagen and extracellular matrix structuring. To conclude, even though the created EYFP-ER-EAPP constructs were not fully functional and did thus not allow to further elucidate the functions of EAPP, the findings made during this project did raise several interesting questions that could provide input for future studies. Two questions of particular significance are whether or not EAPP is sumoylated and what role the phosphorylation of EAPP plays in regulating its transcriptional activity. Vorgelegt von: Katharina Jonas Molecular Biotechnology Wien, FH Campus Wien, Masterarb., 2018 |
