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Unter allergischen Patienten leiden mehr als 33 Millionen Europäer an Ambrosia Pollenallergie. Vorhersagen zeigen, dass die Zahl der Patienten bis 2050 auf 77 Millionen ansteigend wird. Grund dafür sind vor allem verändernde klimatische Bedingungen und die unterstützende Wirkung der Luftverschmutzung auf die hohe Allergenität. Die einzige Allergen-spezifische und krankheitsmodifizierende Therapieform ist die Allergen-spezifische Immuntherapie (SIT). Hier präsentieren wir die umfassende Charakterisierung von zwei Fusionsproteinen, Amb a 1.03 K4.2 und Amb ein 1.03 K4.3 für spezifische Immuntherapie (SIT) von Ambrosia Allergie. Sie basieren auf einem "Peptid / Carrier" -Konzept und enthalten Peptide des hauptsächlichen Ambrosia Allergens Amb a 1, die immunologisch ausgewertet wurden, um ihre Fähigkeit sicherzustellen, Allergen-spezifische IgG-Antikörper zu induzieren, IgE zu inhibieren und zusätzlich keine allergische Reakition zu zeigen. Um jegliche Probleme bei der späteren GMP-Produktion zu vermeiden, wurden Aminosäure-Cystein-Reste, die in der ursprünglichen Sequenz von Amb a 1.03 vorhanden waren, heraus geschnitten oder mit Serinen ausgetauscht. Nach erfolgter Expression in E. coli und Aufreinigung mittels Ni-NTA-Chromatographie, wurden die Fusionsproteine K4.2 und K4.3 hinsichtlich Hypoallergenität, Immunogenität, Stabilität und Lagerbedingungen getestet. Darüber hinaus wurden Formulierungsexperimente durchgeführt, gefolgt von einer Immunisierungsstudie in neuseeländischen Kaninchen. Die Ergebnisse von IgE - ELISA - Experimenten, die Bestimmung von IgG - Titern nach Immunisierung, IgE - Hemmungsexperimente und Basophile Aktivierungstests (BAT - Assays) bestätigten, dass sowohl K4.2 als auch K4.3 - Fusionsproteine nicht IgE - reaktiv (hypoallergen), sondern höchst immunogen sind und des weiteren, dass IgG, die bei den Immunisierungen mit den Fusionsproteinen induziert werden, in der Lage sind, die Bindung von IgE an das Wildtyp allergen Amb a 1 zu blockieren. Diese viel versprechenden Ergebnisse ermutigen uns, in naher Zukunft in die präklinische Entwicklung unseres Prototyp-Impfstoffs zu schreiten, und ein sicheres und wirksames Verfahren für SIT von Ambrosia-Allergien mit einer reduzierten Anzahl von jährlichen Injektionen zu entwickeln. Among allergic patients, more than 33 million Europeans suffer from ragweed pollen allergy. Predictions demonstrate that this number of patients will increase up to 77 million by 2050 due to changing climate condition and the supporting effect of air pollution on the high allergenicity. The only allergen-specific and disease-modifying form of therapy is allergen-specific immunotherapy (SIT). Here, we present the comprehensive characterization of two fusion proteins, named Amb a 1.03 K4.2 and Amb a 1.03 K4.3 for specific immunotherapy (SIT) of ragweed allergy. They are based on a “Peptide-Carrier” concept and contain peptides of the major ragweed allergen Amb a 1 which were immunologically evaluated to ensure their ability to induce allergen-specific IgG antibodies, inhibit IgE and additionally do not show allergenicity. In order to avoid any problems in later GMP production, amino acid cysteine residues present in the original sequence of Amb a 1.03 were deleted or exchanged with serines. After successful expression in E. coli and purification via Ni-NTA chromatography the fusion proteins K4.2 and K4.3 were tested in terms of hypoallergenicity, immunogenicity, stability and storage conditions. In addition, formulation experiments were performed followed by an immunization study in New Zealand rabbits. The results of IgE ELISA experiments, determination of IgG titers after immunization, IgE inhibition experiments and basophile activation tests (BAT assays) confirmed that both, K4.2 and K4.3 fusion proteins are not IgE reactive (hypoallergenic) but highly immunogenic, and that IgG induced upon immunization with the fusion proteins are able to block the binding of ragweed allergic patients’ IgE to wild-type Amb a 1. Both fusion proteins showed under specific conditions high stability and good formulation behavior to alum, hence, both are suitable candidates for ragweed prototype vaccine. These promising results encourage us to move forward in the pre-clinical development of our prototype vaccine, aiming at a safe and efficacious procedure for SIT of ragweed allergy with a reduced number of annual injections. vorgelegt von: Elijahu Babaev Wien, FH Campus Wien, Masterarb., 2017 |
