رسالة جامعية
Nous desenvolupaments en glicosintases. Enginyeria i aplicacions
العنوان: | Nous desenvolupaments en glicosintases. Enginyeria i aplicacions |
---|---|
المؤلفون: | Pérez Javierre, Francesc Xavier |
المساهمون: | University/Department: Universitat Ramon Llull. IQS - Bioenginyeria |
مرشدي الرسالة: | Planas Sauter, Antoni |
المصدر: | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
بيانات النشر: | Universitat Ramon Llull, 2015. |
سنة النشر: | 2015 |
وصف مادي: | 252 p. |
Original Identifier: | B 19984-2015 |
مصطلحات موضوعية: | Glicosintasa, Glycosynthase, Beta-glucà, Beta-glucan, Biopolymer, Glicosidasa, Glycosidase, Immobilization, Carbohydrate, Ciències |
الوصف: | La constatació de la rellevància dels carbohidrats i glicoconjugats en processos de reconeixement cel·lular, regulació i senyalització, proliferació cel·lular i resposta immunitària, així com en funcions estructurals i energètiques reconegudes clàssicament, han portat a un interès creixent en aquestes biomolècules per part de la Glicobiologia i la Ciència dels Materials. Aquest fet ha comportat la necessitat de disposar d’eines complementàries o alternatives a la química convencional per a la síntesi d’aquestes biomolècules i abastir-ne així la demanda generada. Tot això ha propiciat el desenvolupament de noves metodologies sintètiques amb la incorporació d’etapes enzimàtiques. L’any 1998 es va desenvolupar la metodologia glicosintasa basada en un redisseny del centre actiu de glicosidases que actuen amb retenció de configuració per tal de suprimir-ne la seva activitat hidrolítica. L’ús d’aquests enzims modificats permeten la catàlisi eficient de la formació d’enllaços glicosídics quan s’empren donadors glicosídics activats amb la configuració anomèrica oposada a la del substrat de la reacció normal d’hidròlisi En la present Tesi s’aprofundeix en la metodologia glicosintasa tant a nivell mecanístic com aplicat. Es treballa amb dues glicosintases, el mutant E134A de la β-glucanasa de Bacillus lichenisformis i el mutant E383A de β-glucosidasa d’Streptomyces sp. amb les quals s’assoleixen les següents fites: S’estudia la funció del residu D136 en el centre actiu de la glicosintasa E134A de la β-glucanasa de Bacillus lichenisformis. L’anàlisi de dobles mutants, mostra que només el mutant E134A/D136E manté certa activitat glicosintasa, suggerint la seva funció com a residu assistent en el mecanisme enzimàtic. També s’obtenen les glicosintases més actives E134S i E134G de la -glucanasa de Bacillus licheniformis, on la substitució del E134 per Ser resulta en un enzim amb una activitat glicosintasa incrementada 5 vegades (en termes de kcat/KM) en comparació amb el mutant original E134A. Es demostra la utilitat de la glicosintasa E134A de Bacillus licheniformis per sintetitzar 1,3-1,4-β-glucans artificials per polimerització dels donadors disacàrid (Glcβ3GlcαF), trisacàrid (Glcβ4Glcβ3GlcαF) i tetrasacàrid (Glcβ4Glcβ4Glcβ3GlcαF). S’originen polisacàrids constituïts per unitats repetitives dels seus corresponents monòmers units per enllaços β-1,4. La morfologia del polisacàrid depèn de la unitat repetitiva que el forma de manera que per (β4Glcβ3Glc)n i (β4Glcβ4Glcβ4Glcβ3Glc)n s’obtenen esferulites mentre que per (β4Glcβ4Glcβ3Glc)n s’obté un precipitat amorf. Aquests polisacàrids constitueixen nous β-glucans amb estructures homogènies amb una proporció d’enllaços β-1,3 més elevada respecte els β-glucans existents a la natura. El grau de polimerització dels β-glucans obtinguts ve limitat per la solubilitat dels productes de reacció. S’observa que l’ús del mutant més actiu E134S permet estendre la polimerització i assolir polisacàrids d’alt pes molecular en funció de la concentració d’enzim. D’aquesta manera el grau de polimerització (DP) pot ser controlat per l’activitat enzimàtica. Per avaluar la inhibició per producte de l’activitat glicosintasa del mutant E134A se sintetitza l’octasacàrid (β4Glcβ4Glcβ4Glcβ3Glc)2, concloent que el producte de reacció actua com inhibidor competitiu malgrat no té un efecte significatiu en els rendiments preparatius dels productes de polimerització enzimàtica. D’altra banda s’estudia l’activitat glicosintasa del mutant E383A de la β-glucosidasa d’Streptomyces sp. S’observa que aquest presenta activitat hidrolítica i de transglicosidació, fet que queda palès amb la formació de productes secundaris en la reacció glicosintasa. Descartada que aquesta activitat hidrolítica provingui d’una contaminació d’enzim wt, es proposa un mecanisme d’hidròlisi i transglicosidació assistit per anió fluorur com a nucleòfil exogen per la formació d’aquests productes secundaris no esperats. Finalment s’immobilitza amb èxit la glicosintasa E383A de la β-glucosidasa d’Streptomyces sp. sobre reïna Chelating Sepharose FF. L’enzim immobilitzat no mostra millora de la seva estabilitat envers els dissolvents orgànics. No obstant, sí millora pel que fa a estabilitat d’emmagatzemament a 4ºC i pH 7 en comparació amb la seva forma lliure i permet la seva reutilització fins a 9 cicles mantenint el 90% de l’activitat inicial. |
الوصف (مترجم): | La constatación de la relevancia de los carbohidratos y glicoconjugados en procesos de reconocimiento celular, regulación y señalización, proliferación celular y respuesta inmunitaria, así como en las funciones estructurales y energéticas reconocidas de forma clásica, han llevado a un interés creciente en estas biomoléculas por parte de la Glicobiología y de la Ciencia de los Materiales. Este hecho ha comportado la necesidad de disponer de herramientas complementarias o alternativas a la química convencional para la síntesis de estas biomoléculas y poder abastecer así la demanda generada. Todo ello ha propiciado el desarrollo de nuevas metodologías sintéticas con la incorporación de etapas enzimáticas. En 1998 se desarrolló la metodología glicosintasa basada en un rediseño del centro activo de glicosidasas que actúan con retención de configuración con la finalidad de suprimir su actividad hidrolítica. El uso de estas enzimas modificadas permite la catálisis eficiente de la formación de enlaces glicosídicos cuando se utilizan dadores glicosídicos activados con la configuración anomérica opuesta a la del sustrato de la reacción normal de hidrólisis. En la presente Tesis se profundiza en la metodología glicosintasa tanto a nivel mecanístico como aplicado. Se trabaja con dos glicosintasas, el mutante E134A de la β-glucanasa de Bacillus licheniformis y el mutante E383A de la β-glucosidasa de Streptomyces sp., con las que se consiguen los siguientes hitos: Se estudia la función del residuo D136 en el centro activo de la glicosintasa E134A de la β-glucanasa de Bacillus licheniformis. El análisis con dobles mutantes, muestra que solo la variante E134A/D136D mantiene cierta actividad glicosintasa, sugiriendo su función como residuo asistente en el mecanismo enzimático. También se obtienen las glicosintasas más activas E134S y E134G de la β-glucanasa de Bacillus licheniformis, donde la sustitución del E134 por Ser da como resultado una variante con una actividad glicosintasa incrementada 5 veces (en términos de kcat/KM) en comparación con la variante original E134A. Se demuestra la utilidad de la glicosintasa E134A de Bacillus licheniformis para sintetizar 1,3-1,4-β-glucanos artificiales por polimerización de los dadores disacárido (Glcβ3GlcαF), trisacárido (Glcβ4Glcβ3GlcαF) y tetrasacárido (Glcβ4Glcβ4Glcβ3GlcαF). Se originan polisacáridos constituidos por unidades repetitivas de sus correspondientes monómeros unidos por enlaces β-1,4. La morfología del polisacárido depende de la unidad repetitiva que lo forma de manera que para el (β4Glcβ3Glc)n y el (β4Glcβ4Glcβ4Glcβ3Glc)n se obtienen esferulitas mientras que para el (β4Glcβ4Glcβ3Glc)n se obtiene un precipitado amorfo. Estos polisacáridos constituyen nuevos β-glucanos con estructuras homogéneas con una proporción de enlaces β-1,3 más elevada respecto a los β-glucanos existentes en la naturaleza. El grado de polimerización de los β-glucanos obtenidos viene limitado por la solubilidad de los productos de reacción. Se observa que el uso de la variante más activa E134S permite extender la polimeritzación y conseguir polisacáridos de alto peso molecular en función de la concentración de enzima. De esta manera el grado de polimerización (DP) puede controlarse mediante la actividad enzimática. Para evaluar la inhibición por producto de la actividad glicosintasa de la variante E134A se sintetiza el octasacárido (β4Glcβ4Glcβ4Glcβ3Glc)2, concluyendo que el producto de reacción actúa como inhibidor competitivo aunque no tiene un efecto significativo en los rendimientos preparativos de los productos de polimerización enzimática. Por otra parte, se estudia la actividad glicosintasa de la variante E383A de la β-glucosidasa de Streptomyces sp. Se observa que este mutante presenta actividad hidrolítica y de transglicosidación, hecho que queda patente con la formación de productos secundarios en la reacción glicosintasa. Una vez descartada que la actividad hidrolítica provenga de una contaminación por enzima wt, se propone un mecanismo de hidrólisis y transglicosidación asistido por anión fluoruro como nucleófilo exógeno para la formación de estos productos secundarios no esperados. Finalmente se inmoviliza con éxito la glicosintasa E383A de la β-glucosidasa de Streptomyces sp. sobre resina Chelating Sepharose FF. La enzima inmovilizada no muestra mejora en cuanto a estabilidad frente a disolventes orgánicos. No obstante, sí mejora en términos de estabilidad de almacenamiento a 4ºC y pH 7 en comparación con la forma libre y permite su reutilización hasta 9 ciclos manteniendo el 90% de la actividad inicial. The verification of the relevance of carbohydrates and glycoconjugates in cellular recognition processes, regulation and signaling, cellular proliferation and immunologic response, as well as in structural and energetic functions, has led to an increasing interest in these biomolecules from Glicobiology and Material Science. This fact has turned into a necessity to endow this increasing demand with synthetic tools that are alternative or complementary to conventional chemistry. This has prompted the development of new synthetic methodologies with the inclusion of enzymatic steps. In 1998, Glycosynthase methodology was developed. Glycosynthases are mutated retaining glycosidases in which the catalytic nucleophile has been replaced by an inert residue, resulting in an enzyme hydrolytically inactive but able to catalyze the formation of glycosidic bonds with glycosyl fluoride donors having the opposite anomeric configuration than the normal substrate of the wild-type enzyme. This Thesis goes into detail about the Glycosynthase methodology both on a mechanistic and applied level. Two glycosynthases are used for this purpose, the E134A mutant of the -glucanase from Bacillus licheniformis and the E383A mutant of the -glucosidase from Streptomyces sp., with the following results: The function of D136 residue in the catalytic site of the E134A glycosynthase is studied. The analysis with double mutant shows that only the E134A/D136G mutant maintains some glycosynthase activity, suggesting that it acts as an assistant residue in the enzymatic mechanism. Additionally, the more active glycosynhases E134S and E134G are obtained, where the substitution of E134 for serine results in a five-fold reactivity increase (in terms ofkcat/KM) compared to the original E134A glycosynthase. The E134A glycosynthase derived frorm the Bacillus licheniformis -glucanase is able to synthesize artificial 1,3-1,4--glucans by polymerization of the following glycosyl fluoride donors: Glcβ3GlcαF, Glcβ4Glcβ3GlcαF and Glcβ4Glcβ4Glcβ3GlcαF. These polysaccharides are formed by repeating units of their corresponding monomers connected by 1,4 linkages. Polysaccharide morphology depends on the repeating unit, so that for the (β4Glcβ3Glc)n and the (β4Glcβ4Glcβ4Glcβ3Glc)n spherulites are observed whereas for the (β4Glcβ4Glcβ3Glc)n an amorphous precipitated is recovered. These polysaccharides are new artificial -glucans with regular structures presenting a 1,3 linkage content higher than observed in nature. The degree of polymerization of the new -glucans is limited by the solubility of the reaction products. The use of the more active E134S mutant allows reaching larger polymers and rendering high molecular mass polysaccharides as a function of enzyme concentration. In this way, the degree of polymerization (DP) can be modulated by enzyme activity. In order to evaluate the product inhibition of the glycosynthase reaction catalyzed by the E134A mutant, the octasaccharide substrate (β4Glcβ4Glcβ4Glcβ3Glc)2, is synthesized, concluding that the reaction product acts as a competitive inhibitor, even though there is not a significant effect on the preparative yields of the enzymatic polymerization products. On the other hand, the E383A glycosynthase derived from the Streptomyces sp. is studied. This mutant presents both hydrolytic and transglycosidation activity, thus the formation of secondary products on the glycosynthase reaction is observed. No contamination of wt enzyme is detected. An hydrolytic and transglycosidation mechanism concerning assisted by fluoride as an exogenous nucleophile is proposed as an explanation for the formation of unexpected secondary products. Finally, E383A β-glucosidasa from Streptomyces sp. is immobilized on Chelating Sepharose FF resin. Immobilization does not increase stability to organic solvents, but the storage stability at 4ºC and pH 7 is clearly enhanced. Additionally, the operation stability is improved, thus the immobilized enzyme maintains 90% of activity along 9 operational cycles. |
نوع الوثيقة: | Dissertation/Thesis |
وصف الملف: | application/pdf |
اللغة: | Catalan; Valencian |
URL الوصول: | http://hdl.handle.net/10803/299201 |
حقوق: | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
رقم الأكسشن: | edstdx.10803.299201 |
قاعدة البيانات: | TDX |
الوصف غير متاح. |