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La reestenosis es un proceso patológico consistente en la reoclusión excesiva de un vaso intervenido mediante angioplastia coronaria percutánea transluminal (ACPT), tratamiento frecuentemente utilizado para la revascularización de vasos afectados de arterioesclerosis. La reestenosis se desarrolla normalmente durante los primeros 4-12 meses tras la ACPT y tiene un elevado impacto sanitario y socio-económico, pues obliga a la revascularización del paciente, bien repitiendo la ACPT o mediante “by-pass” aortocoronario. Actualmente, el 90% de las ACPT se realiza mediante el uso de endoprótesis metálicas de soporte denominadas stents. Estos dispositivos mejoran la seguridad del proceso de intervención al reducir las tasas de reestenosis comparado con la ACPT convencional (15-30% comparado con 25-50%, respectivamente), debido principalmente a que evitan el remodelado negativo del vaso. La reciente introducción de stents liberadores de fármacos antiproliferativos (ST-FA) ha supuesto una revolución en la cardiología intervencionista al reducir un 60-80% las tasas de reestenosis en comparación con los stents convencionales. Los ST-FAs liberan de forma local drogas lipofílicas, tales como el sirolimus (rapamicina, rapamune) o el paclitaxel (taxol), que bloquean el ciclo celular, diminuyendo la proliferación celular y consecuentemente la reestenosis asociada a revascularización con stent. La reestenosis es una enfermedad de tipo hiperproliferativo iniciada por el daño mecánico que sufre el endotelio vascular que tapiza la pared arterial como consecuencia de la implantación del stent. El proceso inflamatorio iniciado posteriormente al daño endotelial desencadena la conversión de las células de músculo liso de la túnica media hacia un fenotipo caracterizado por una alta actividad proliferativa y migratoria, así como por la síntesis de componentes de la matriz extracelular, dando lugar en último término al engrosamiento de la lesión neoíntima. La correcta evolución tras la ACPT depende de la resolución de la inflamación y de la cicatrización de la herida gracias a una completa re-endotelización de la zona dañada. En este sentido, la inhibición indiscriminada de la proliferación celular por los ST-FAs afecta a la correcta re-endotelización del vaso intervenido, lo cual constituye la causa principal del elevado riesgo de sufrir trombosis tardía asociada al uso de estos stents. Así, los pacientes tratados con un ST-FA deben prolongar la terapia dual antitrombótica y antiplaquetaria para evitar la tombrosis tardía tras ACPT que se asocia con un elevado riesgo de mortalidad. Por tanto, uno de los principales objetivos de la cardiología intervencionista es la búsqueda de marcadores que permitan la identificación del riesgo individual de sufrir reestenosis tras ACPT, lo cual ayudaría en la toma de decisiones terapéuticas, por ejemplo la implantación de stent versus “by-pass” ortocoronario, o uso de stent convencional versus ST-FA dependiendo del riesgo individual de sufrir reestenosis. Sin embargo, a diferencia de la aterosclerosis nativa, no existen biomarcadores del riesgo de sufrir reestenosis. En los últimos años han ido en aumento los estudios basados en el análisis de genes candidatos que asocian polimorfismos genéticos con el riesgo individual a sufrir enfermedades complejas. Existen diversos trabajos que asocian polimorfismos de base única (SNP: single nucleotide polymorphism) en diversos genes humanos que se asocian con la susceptibilidad a desarrollar reestenosis. Es interesante destacar que Van tiel y colaboradores demostraron recientemente que el genotipo -838AA para el SNP -838(C>A) localizado en el gen supresor de tumores p27Kip1 se asocia a un riesgo disminuido de sufrir reestenosis tras ACPT debido probablemente a un aumento de la actividad promotora de este regulador negativo de la proliferación celular. El objetivo principal del proyecto es determinar si existe alguna variante genética (SNPs) en genes reguladores de ciclo celular que permita predecir el riesgo de sufrir reestenosis coronaria tras implantación de stents. El análisis de una cohorte de 284 pacientes sometidos a angioplastia con implantación de stent coronario mostró que los SNPs rs350099 (-957[T/C]), rs350104 (-475[T/C]), rs164390 (+102[G/T]) y rs875459 (+7010[G/T]) (localizados en el gen CCNB1, que codifica para la proteína ciclina B1), rs2282411 (+7733[T/C], localizado en el gen CCNA1, que codifica para la proteína ciclina A1) y el polimorfismo rs733590 (-1284[T/C]), localizado en el gen CDKN1A, que codifica para la proteína p21Cip1) se asocian con un riesgo aumentado de sufrir reestenosis tras implantación de stent coronario. Dada su localización en la región promotora de un mismo gen, CCNB1, el análisis de los polimorfismos -957[T/C], (-475[T/C]) y (+102[G/T]) en una segunda cohorte de 715 pacientes permitió validar la asociación con el riesgo de sufrir reestenosis tras implantación de stent coronario. Además, las variantes de riesgo de los polimorfismos -957[T/C], (-475[T/C]) y (+102[G/T]) se asocian con un aumento de la expresión de genes reporteros a través de la unión de los factores de transcripción NF-Y, AP-1 y SP1, respectivamente. El haplotipo formado por las variantes de riesgo de estos 3 polimorfismos se asocian, a su vez, con niveles aumentados de ciclina B1 en linfocitos circulantes y con un riesgo aumentado de sufrir reestenosis. La identificación del factor de transcripción NF-Y, conocido regulador de la transcripción de diversos genes reguladores del ciclo celular (incluida la ciclina B1), nos llevó a estudiar su papel en el contexto de la enfermedad vásculo-proliferativa. Mediante estudios moleculares y de expresión en células en cultivo, modelos animales y tejidos humanos demostramos que el PDGF-BB, conocido inductor del desarrollo de la lesión neoíntima, induce el reclutamiento de NF-Y al promotor de la ciclina B1 aumentando tanto su expresión de ARN mensajero como la proliferación celular de células de músculo liso vascular de rata y humano a través de las rutas de señalización Erk1/2 y Akt. Además, encontramos co-expresión de NF-Y y ciclina B1 en regiones proliferativas en placas ateroscleróticas y lesiones inducidas mecánicamente murinas. Por otro lado, la sobreexpresión de un mutante dominante negativo de una de las subunidades de NF-Y, NF-YA, inhibe la expresión de ciclina B1 y la proliferación celular inducida por PDGF-BB y la formación in vivo de la lesión neoíntima en un modelo de daño endoluminal de la arteria femoral común. Por último, demostramos que NF-Y se expresa y es activo en lesiones ateroscleróticas y reestenóticas humanas. En resumen, hemos identificado a NF-Y como un regulador positivo de la expresión de la ciclina B1, de la proliferación celular de las CMLVs y del desarrollo de la lesión neoíntima. En este sentido, hemos detectado la sobreexpresión y activación de NF-Y en lesiones reestenoticas y ateroscleróticas, tanto en modelos animales como en muestras humanas. Además, hemos identificado variantes polimórficas de los SNPs rs350099 (-975T/C), rs350104 (-475 T/C) y rs164390 (+102G/T) localizados en la región promotora del gen CCNB1 humano asociados a un mayor riesgo de sufrir ISR tras implantación de stent coronario que generan sitios de unión para los factores de transcripción NF-Y, AP-1 y SP1, respectivamente. De hecho, el haplotipo portador de las variantes alélicas de mayor riesgo de estos polimorfismos se asocia con niveles aumentados de ARNm de CCNB1 y con una mayor susceptibilidad a desarrollar ISR post-stent. Además, identificamos que los polimorfismos rs2282411 y rs733590 se asocian también con un riesgo aumentado de sufrir reestenosis tras implantación de stent coronario. Por lo tanto, nuestros estudios sugieren que pacientes portadores del genotipo -957TT/-475CC/+102GG presentan un reclutamiento aumentado de las proteínas NF-Y, AP-1 y SP1 que puede contribuir al mayor riesgo de sufrir ISR tras implantación de stent como resultado de un aumento de los niveles de ciclina B1 y de la proliferación de las CMLVs. |
| الوصف (مترجم): |
Restenosis is the major limitation of atherosclerotic vessels revascularization procedure via angioplasty percutaneous coronary intervention (APCI). Restenosis, a disease that occurs during first 4-12 months after APCI, has a high economic and clinical impact due to the necessity of repeat restenotic vessel revascularization via APCI or coronary artery bypass grafting. Nowadays, APCI is performed via the implantation of a metallic prosthesis called stent. These devices improves the safety of the procedure through reducing restenosis rates compared to conventional APCI (15-30% vs 25-50%) by avoiding negative remodeling of the target vessels. The recently introduction of drug eluting stents (DES) has supposed a revolution of interventional cardiology by reducing restenosis rates (60-80%) compared to conventional stents. DES deliver lipophilic drugs (i.e sirolimus or paclitaxel) locally that block cell cycle, inhibit cell proliferation and reduce restenosis rates. Restenosis is a hiperproliferative disease initiated by mechanically-induced endothelial damage due to stent deployment. Endothelial damage triggers an inflammatory response that activates vascular smooth muscle cells (VSMC) to a “synthetic” phenotype characterized by high proliferative and migratory response and elevated extracellular matrix components production. These events end up with the neointimal lesion development and vessel re-occlusion. The proper process development requires inflammation resolution and complete re-endothelization of affected lesion. In this sense, unselective inhibition of cell proliferation by DES dampers re-endothelization causing an increase in the risk to suffer late thrombosis (a feature of these stents). Therefore, considering the socioeconomic impact of restenosis and drawbacks associated to use of DES respect to BMS appears to be necessary identify biomarkers of the risk of restenosis in order to stratify patients to develop a patient-tailored therapy. During last years, increasing evidence suggest the association of genetic polymorphisms with the risk to suffer complex diseases. Severals studies demonstrate that single nucleotide polymorphisms (SNPS) located in different human genes are associated with increased in-stent restenosis (ISR). Interestingly, Van tiel and colleagues demonstrated that -838AA individuals (SNP -838(C>A) within the p27Kip1 gene) show reduced ISR risk probably due to reduced promoter activity. The goal of this work is to identify SNPs in cell cycle regulatory genes that predict ISR risk after coronary stent deployment. Our analysis of a cohort of 284 patients undergoing coronary angioplasty and stent deployment showed that SNPs rs350099 (-957[T/C]), rs350104 (-475[T/C]), rs164390 (+102[G/T]) y rs875459 (+7010[G/T]) (located in CCNB1 gene, codifying cyclin B1 protein), rs2282411 (+7733[T/C], located in CCNA1 gen, codifying cyclin A1) and rs733590 polymorphism (-1284[T/C]), located in CDKN1A gene, codifying p21Cip1 protein) are associated with increased ISR risk. Based on its location in CCNB1 promoter region, analysis of -957[T/C], (-475[T/C]) y (+102[G/T]) polymorphisms in additional 715 patients cohort also showed significant association with increased ISR risk. Moreover, risk allelic variants of -957[T/C], (-475[T/C]) y (+102[G/T]) polymorphisms are associated with increased reporter gene expression through NF-Y, AP-1 and SP1 transcription factors, respectively. High risk alleles containing haplotype is associated with augmented cyclin mRNA levels in peripheral blood lymphocytes and increased ISR risk. The identification of NF-Y transcription factor, known controller of cell cycle regulation gene transcription (cyclin B1 included), led us to investigate its role in the context of vasculo-proliferative diseases. By using molecular and expression studies in cultured cells, animal models and human tissues we demonstrate that platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), a main inductor of neointimal lesion development, induces in rat and human VSMCs the recruitment of NF-Y to the CCNB1 promoter and augments both CCNB1 mRNA expression and cell proliferation through extracellular signal-regulated kinase 1/2 (Erk1/2) and Akt activation. We find co-expression of NF-Y and cyclin B1 in proliferative regions of murine atherosclerotic plaques and mechanically-induced lesions, which correlates with higher binding of NF-Y to target sequences in the CCNB1 promoter. Moreover, adenovirus-mediated overexpression of a NF-YA dominant-negative mutant inhibits PDGF-BB-induced CCNB1 expression and VSMC proliferation in vitro and neointimal lesion formation in a mouse model of femoral artery injury. We also detect NF-Y expression and DNA-binding activity in human neointimal lesions. In summary, we have identified NF-Y as a key positive regulator of cyclin B1 expression, VSMC proliferation and neointimal lesion formation. We have also found overexpression and activation of NF-Y in restenotic and atherosclerotic lesions, both in animal models and human samples. Moreover, we have identify polymorphic variants of rs350099 (-975T/C), rs350104 (-475 T/C) y rs164390 (+102G/T) within human CCNB1 promoter region that are associated with increased risk of ISR and generates novel NF-Y, AP-1 and SP1 DNA-binding sites, respectively. In fact, high risk haplotype is associated with increased cyclin B1 mRNA levels and augmented ISR risk. In addition, we also found significant association of rs2282411 and rs733590 polymorphisms with increased ISR risk. Therefore, our studies suggest that individuals carrying -957TT/-475CC/+102GG genotype show increased NF-Y, AP-1 and SP1 recruitment contributing through higher cyclin B1 levels and VSMC proliferation to increased ISR risk after coronary stent deployment. |
